锐谈 | Nat. Commun：代谢工程酿酒酵母从头生物合成甜菊苷和莱鲍迪苷

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发布时间：2023-06-26 15:44
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江南大学刘龙老师团队以酿酒酵母为底盘菌株从头合成代糖甜茶苷和莱鲍迪苷，最终在15L发酵罐中从头合成1368.6 mg/L和132.7 mg/L的甜茶苷和莱鲍迪苷。

首先分为5个模块构建甜茶苷的生物合成途径，分别是：

①萜烯合成模块：引入Gibberella fujikuroi来源的 kaurene synthase(KS)、过表达MVA pathway的关键酶tHMG1和IDI1、引入法尼基焦磷酸合成酶的突变体FPSF112A，以减少对FPP的消耗，而FPP可用于合成其他对细胞生长所必须得物质；

②P450s模块：引入Stevia rebaudiana来源的KO（ent-kaurene氧化酶）以及一种细胞色素P450s还原酶CPR1和Arabidopsis thaliana来源的KAH（kaurenoic acid 13α羟化酶）；

③甜茶苷合成模块：引入S. rebaudiana来源的两种UDP糖基转移酶UGT74G1和UGT85C2；

④UDP-葡萄糖合成模块；

⑤甜茶苷输出模块：经液相检测和质谱分析确定，工程菌株SGN06产生了4.5 mg/L的甜茶苷。

接着，找到限速步骤并消除：

①分别过表达P450s模块中的三种酶，发现过表达KO使得甜菊醇steviol的产量提高91.3%；

②发现KAH和CPR1含有跨膜结构域（TMD），当截短CPR1的TMD（trCPR1）使得steviol滴度增加231.2%，而当截短KAH的TMD无法合成steviol；

③为优化底物运输通过短蛋白接头（GGGGS3）融合表达这些酶，融合表达KAH-GGGGS3-trCPR1使得steviol产量最高达40.6 mg/L，此时将UGT模块基因整合上去得到32.2 mg/L的甜菊苷，是初始菌株的7.2倍；

④为平衡内质网（ER）蛋白合成负荷及其折叠能力，用更强的启动子（PGK1启动子，PGK1p）取代其内源性启动子（INO2p）来过表达ER大小调节因子INO2，甜菊苷滴度增加至67.7 mg/L。

之后，提高酵母宿主对甜菊苷的耐受能力：

①由于在胞外检测到产物，推测酵母质膜中可能存在主动外排系统来输出甜菊苷，通过将产物与Alpha Fold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk/) 数据库的转运蛋白对接发现与ABC转运蛋白的亲和力最高，通过质粒分别过表达外排泵，发现过表达PDR11使甜菊苷的产量增加129.8%达155.6 mg/L；

②细胞应激反应调节可以触发运输机制，并增加对真菌苛刻发酵条件的适应。在对六种不同的应激反应因子的研究中发现，MSN4的转录水平随着甜菊苷含量的增加而升高。当MSN4在菌株SGN08中使用质粒pY16-TEF1p过表达时，甜菊苷滴度增加了2倍，达到205.5 mg/L

但两种策略共同使用不能使产量更高，需要提高代谢通路流量。

最后，通过基因组规模的代谢模型对工程目标进行计算机预测：通过计算机模拟分析分别敲除5个靶标，当GAL7被敲除时，甜菊苷滴度增加了19.4%达247.2 mg/L，阻断GAL7可能有利于葡萄糖-1-磷酸（Glc-1P）转化为UDP葡萄糖，这表明UDP葡萄糖浓度可能是SGN13中甜菊苷产生的限速因素，在敲除GAL7的菌株中过表达PGM2（磷酸葡萄糖突变酶）使甜菊苷滴度提高到302.1 mg/L

最终在15-L生物反应器中补料分批发酵中表现最好的菌株（SGN23）甜菊苷滴度达到1368.6 mg/L，这是迄今为止达到的最高滴度。